一、前言
生物(wù)素-親和素（鏈黴親和素）系統因其具(jù)有(yǒu)的特異性高親和力和級聯放大效應，已被廣泛應用(yòng)于臨床檢驗領域當中(zhōng)。樣本中(zhōng)高濃度生物(wù)素可(kě)能(néng)會對該檢測系統産(chǎn)生幹擾。日常的生物(wù)素攝入量通常不會産(chǎn)生幹擾，但是近來随着高劑量生物(wù)素的攝入以及更高劑量生物(wù)素的治療措施，生物(wù)素對體(tǐ)外診斷試劑的幹擾以及對臨床檢驗造成的風險引起人們廣泛關注。由于高劑量生物(wù)素的攝入人群分(fēn)布評估差異很(hěn)大，因此引起的不良事件也多(duō)有(yǒu)報道。由于在一項藥物(wù)臨床實驗中(zhōng)觀察到因生物(wù)素幹擾引起的檢測結果不準确而導緻嚴重不良事件，FDA先後出台了應對生物(wù)素幹擾的警示信息及相應指南。IVD生産(chǎn)企業也采取不同的措施來降低生物(wù)素幹擾的影響。以下從生物(wù)素-親和素系統、生物(wù)素幹擾機制、解決幹擾的方法、對監管的思考等幾個方面對該問題進行探讨。
二、生物(wù)素-親和素系統
生物(wù)素（biotin），又(yòu)稱為(wèi)維生素B7，維生素H，輔酶R，是一種水溶性維生素，分(fēn)子量僅有(yǒu)244.31Da，在細胞中(zhōng)作(zuò)為(wèi)一種重要的輔酶，參與多(duō)條代謝(xiè)途徑，如糖代謝(xiè)、脂肪酸合成、氨基酸代謝(xiè)、糖原異生等。在體(tǐ)内生物(wù)素存在結合與遊離兩種形态，大約12%的生物(wù)素是共價結合，7%為(wèi)可(kě)逆結合，其餘80%左右為(wèi)遊離生物(wù)素。人體(tǐ)需要從外界攝入生物(wù)素來滿足自身需求，通常通過膳食補充即可(kě)。生物(wù)素天然存在于多(duō)種食物(wù)（如蛋、肉、谷物(wù)、綠色蔬菜等）中(zhōng)，也可(kě)由腸道細菌合成。在複合維生素、孕期維生素以及促進頭發、皮膚和指甲生長(cháng)的營養品中(zhōng)也含有(yǒu)較高計量生物(wù)素。此外高劑量的生物(wù)素也可(kě)非處方用(yòng)于糖尿病、脂代謝(xiè)異常、生物(wù)素合成酶缺乏、羧化酶缺乏以及周圍神經病變的醫(yī)學(xué)用(yòng)途。
圖1. 生物(wù)素的結構
親和素（avidin）是一種糖蛋白，分(fēn)子量為(wèi)67~68kd，每個分(fēn)子由四個亞基組成，能(néng)夠與4個生物(wù)素緊密結合。Neutravidin和鏈黴親和素（streptavidin）類似，是去除糖基化的親和素，分(fēn)子量小(xiǎo)于avidin，偏中(zhōng)性，其保留了對生物(wù)素的高親和力，但是非特異結合特性降低。鏈黴親和素從親和素鏈黴菌（Streptomyces avidinii）中(zhōng)分(fēn)離，因其更低的非特異性而得到廣泛應用(yòng)。
生物(wù)素-親和素系統（Biotin-（Strept）Avidin System，BAS）是70年代末發展起來的一種新(xīn)型生物(wù)反應放大系統。生物(wù)素可(kě)與大多(duō)數蛋白、酶及其他(tā)分(fēn)子的氨基共價結合形成偶聯物(wù)，親和素也可(kě)通過共價鍵連接到修飾的磁珠、固相載體(tǐ)等介質(zhì)上，而1分(fēn)子親和素可(kě)與4分(fēn)子生物(wù)素以非共價鍵的形式形成高親和力的結合，并且可(kě)以耐受pH值的變化、去污劑、多(duō)次洗脫步驟、螯合劑以及其他(tā)極端反應條件（如溫度）。生物(wù)素與親和素之間的高親和力與級聯放大效應使BAS的免疫标記和有(yǒu)關的示蹤分(fēn)析更加靈敏，在不同檢測系統在醫(yī)學(xué)檢驗領域得到廣泛應用(yòng)。大約85%常見的化學(xué)發光分(fēn)析儀采用(yòng)了基于BAS的檢測方法。
三、樣本中(zhōng)的生物(wù)素對BAS檢測系統的幹擾
1. 生物(wù)素幹擾的機制
生物(wù)素幹擾是基于BAS的檢測方法中(zhōng)普遍存在的問題。采用(yòng)親和素-生物(wù)素系統進行免疫檢測時，如果待測樣本中(zhōng)存在高濃度的遊離生物(wù)素，将與生物(wù)素化抗體(tǐ)競争結合親和素的結合位點，若超過耐受的阈值，有(yǒu)可(kě)能(néng)影響檢測結果。
生物(wù)素幹擾生物(wù)素化免疫檢測的機制因檢測原理(lǐ)不同而不同。生物(wù)素的幹擾在競争法和夾心法中(zhōng)表現出相反的方向。當生物(wù)樣本含有(yǒu)過量的生物(wù)素時，生物(wù)素會與生物(wù)素化抗體(tǐ)或抗原競争結合到鏈黴親和素包被的磁性表面，導緻生物(wù)素化抗體(tǐ)或抗原的捕獲減少。過量的生物(wù)素會在夾心免疫測定中(zhōng)産(chǎn)生錯誤的低結果，因為(wèi)測定信号與分(fēn)析物(wù)濃度成正比。在競争性免疫測定中(zhōng)，過量的生物(wù)素會導緻結果錯誤地升高，因為(wèi)測定信号與分(fēn)析物(wù)濃度成反比。競争法通常用(yòng)于小(xiǎo)分(fēn)子的檢測，如睾酮，雌二醇、皮質(zhì)醇、類固醇、T3（三碘甲狀腺原氨酸）和T4、羟基維生素D等。已有(yǒu)多(duō)篇文(wén)獻描述了生物(wù)素幹擾的具(jù)體(tǐ)細節。
2. 生物(wù)素幹擾依賴于幾個因素：免疫檢測試劑的組成及檢測原理(lǐ)、患者服用(yòng)生物(wù)素的劑量，樣本中(zhōng)生物(wù)素的濃度，以及從最後一次服用(yòng)生物(wù)素到樣本采集的時間間隔等。
外源過量生物(wù)素不太會對不采用(yòng)生物(wù)素和鏈黴親和素系統的檢測方法産(chǎn)生幹擾，對于采用(yòng)生物(wù)素-親和素系統的檢測試劑則需要充分(fēn)評估生物(wù)素可(kě)能(néng)産(chǎn)生的幹擾。
每日攝入的生物(wù)素在不同年齡與狀态的人群中(zhōng)參考量不同。美國(guó)推薦的生物(wù)素攝入量不同人群有(yǒu)所不同，總體(tǐ)在5~35μg/d的範圍。中(zhōng)國(guó)居民(mín)膳食生物(wù)素參考攝入量AI适宜攝入量）值為(wèi)5~50 μg/d。
高劑量的攝入生物(wù)素有(yǒu)可(kě)能(néng)使人體(tǐ)樣本中(zhōng)的生物(wù)素超過檢測試劑的阈值從而幹擾檢測結果。以美甲、護膚、美發為(wèi)目的生物(wù)素攝入可(kě)高達1250~2500μg/d，而多(duō)發性硬化症患者服用(yòng)高達300mg/d的生物(wù)素，其他(tā)一些生物(wù)素缺乏的相關罕見病每日服用(yòng)的生物(wù)素劑量也達到10~40mg。
血液中(zhōng)的生物(wù)素濃度及代謝(xiè)動力學(xué)不同研究有(yǒu)不同結果。30 μg/日的生物(wù)素攝入量，正常循環濃度通常為(wèi) 0.1 至 0.8 ng/mL。生物(wù)素在攝入後迅速吸收，并在 1 至 2 小(xiǎo)時内達到血漿濃度峰值。口服 10 mg 劑量，相當于非處方藥中(zhōng)的一些最高劑量，導緻血漿峰濃度範圍為(wèi) 55 至 140 ng/mL (225~573 nmol/L)。而口服劑量100mg 導緻血漿峰濃度範圍為(wèi) 375 至 450 ng/mL (1535~1842 nmol/L)。多(duō)發性硬化症患者口服生物(wù)素300mg/d，可(kě)導緻血漿/血清生物(wù)素水平大于1000ng/mL。當每日攝入500mg生物(wù)素，會導緻血液中(zhōng)的生物(wù)素濃度非常高，從而幹擾檢測結果。
不同試劑受到生物(wù)素幹擾的程度也不同，生物(wù)素幹擾水平從31.35 ~1000 ng/mL（ 0.13~4.09 μM）不等。
生物(wù)素積累效應也确實存在。研究結果顯示，每天連續給藥到第 7 天的循環濃度是 第 1 天同一時間點的兩倍。研究數據表明持續攝入生物(wù)素 3 天後可(kě)達到穩态濃度。
此外攝入的生物(wù)素濃度不同，血液中(zhōng)的清除半衰期也不同，血漿生物(wù)素的半衰期為(wèi)110分(fēn)鍾，理(lǐ)論上5.5個半衰期（大約9小(xiǎo)時）可(kě)以從血循環中(zhōng)清除。低濃度的生物(wù)素從健康個體(tǐ)的循環中(zhōng)迅速清除，消除半衰期約為(wèi) 2 小(xiǎo)時，而高劑量實驗表明半衰期長(cháng)達 18.8 小(xiǎo)時。一項針對表觀健康個體(tǐ)的藥代動力學(xué)研究表明，口服生物(wù)素劑量為(wèi)1、5、10、100 和 300 毫克的生物(wù)素之後，分(fēn)别在1、5.5、20、108 和 146 小(xiǎo)時後，血液濃度預計會降至 20 ng/mL (81.9 nmol/L) 以下。但是生物(wù)素的清除還受到腎功能(néng)的影響。文(wén)獻報道中(zhōng)血漿的中(zhōng)生物(wù)素濃度僅是遊離生物(wù)素，而實際上生物(wù)素與蛋白存在着可(kě)逆的結合。
目前沒有(yǒu)充分(fēn)證據來明确服用(yòng)生物(wù)素後多(duō)長(cháng)時間再檢測會消除生物(wù)素幹擾對檢測結果的影響。
越來越多(duō)的文(wén)獻表明在促甲狀腺激素 (TSH) 、甲狀腺素等甲狀腺功能(néng)檢測、甲狀旁腺激素 (PTH)、促腎上腺皮質(zhì)激素、催乳素、睾酮、皮質(zhì)醇等内分(fēn)泌檢測、腫瘤标志(zhì)物(wù)、心髒功能(néng)性标志(zhì)物(wù)等檢測中(zhōng)均不同程度收到生物(wù)素的幹擾。在許多(duō)此類案例研究中(zhōng)，當患者停止服用(yòng)生物(wù)素時，受影響的實驗室結果發生顯著變化證實了生物(wù)素幹擾的存在。
四、降低生物(wù)素幹擾的方法
1. 系列稀釋樣本再進行檢測。
2. 換一個對生物(wù)素不敏感的檢測方法進行檢測，如液相質(zhì)譜法等，而質(zhì)譜法通常需要送到參考實驗室進行檢測。
3. 待生物(wù)素在體(tǐ)内清除後再重複檢測，但是該方法現實中(zhōng)不易執行，患者通常意識不到生物(wù)素可(kě)能(néng)會産(chǎn)生幹擾。所需的時間與服用(yòng)的生物(wù)素劑量，腎功能(néng)等多(duō)種因素有(yǒu)關, 短則2小(xiǎo)時可(kě)清除低劑量的生物(wù)素，長(cháng)則可(kě)需15天（如甲狀腺功能(néng)檢測試劑）甚至數月才能(néng)清除。對于多(duō)發性硬化症或其他(tā)生物(wù)素缺乏相關疾病的人群來說延長(cháng)時間重新(xīn)檢測不太适用(yòng)。
4. 清除遊離生物(wù)素後再進行檢測。樣本中(zhōng)的生物(wù)素可(kě)以通過包被有(yǒu)親和素/鏈黴親和素的固相介質(zhì)上（如磁珠、瓊脂微珠、矽化微珠等），與樣本混合孵育後去除親和素-親和素複合物(wù)。結合鏈黴親和素的多(duō)聚物(wù)可(kě)以預裝(zhuāng)到小(xiǎo)的注射器中(zhōng)，方便加載含生物(wù)素的樣本。需要注意的是清除方案需要全面評估後才能(néng)應用(yòng)。盡管經過生物(wù)素清除後的檢測結果不能(néng)報告，但是可(kě)以提醒幹擾的存在，讓患者避免攝入生物(wù)素後一定時間再次取樣進行檢測。羅氏開發了專利抗體(tǐ)清除遊離生物(wù)素減少樣本中(zhōng)的遊離生物(wù)素。
5. 通過臨床一緻性進行驗證。
對于企業而言，開發不受生物(wù)素幹擾的體(tǐ)系需要改變試劑的組成、進行充分(fēn)的性能(néng)驗證、并且獲得監管機構的批準。
對于醫(yī)療結構與患者，均應當意識到樣本中(zhōng)高劑量的生物(wù)素可(kě)能(néng)産(chǎn)生幹擾，從而避免誤診或者采取錯誤的治療措施。
須注意的是生物(wù)素僅僅是可(kě)能(néng)産(chǎn)生幹擾的一個因素之一。對于檢測結果的幹擾，可(kě)能(néng)是由多(duō)個影響因素共同起作(zuò)用(yòng)，例如嗜異性抗體(tǐ)(如HAMA，HAAA)等，其他(tā)常見内源性幹擾物(wù)質(zhì)（如溶血、高血脂、高膽紅素等）等。因此需要更全面的進行分(fēn)析，結合臨床表型以及其他(tā)驗證方法對結果進行綜合判斷。
五、監管思考
對于以生物(wù)素-親和素系統為(wèi)基本原理(lǐ)的IVD試劑，樣本中(zhōng)生物(wù)素對檢測系統的幹擾性是在産(chǎn)品設計開發中(zhōng)就需要考慮的問題。對于生物(wù)素幹擾性的研究，EP37(2018年)文(wén)件中(zhōng)顯示生物(wù)素的最高藥物(wù)濃度為(wèi)1.17E-01mg/dL (1.17ng/mL), 建議的檢測濃度為(wèi)3.51ng/mL。按照FDA的推薦劑量攝入30μg/d生物(wù)素通常不會對3.51ng/mL的阈值的産(chǎn)品産(chǎn)生生物(wù)素幹擾。但是随着生物(wù)素攝入量的增加以及不良反應的不斷報道，FDA先後發布警示信以及相關指南對生物(wù)素幹擾進行監管，将需要研究的生物(wù)素最高濃度設定到3500ng/mL。
部分(fēn)企業已經在陸續按照指南要求對各自的相關産(chǎn)品進行生物(wù)素幹擾評估，并采取不同的措施提高産(chǎn)品抗生物(wù)素幹擾性能(néng)，使其能(néng)夠耐受高濃度的生物(wù)素幹擾，如在說明書增加警示信息注明相關風險，或者優化産(chǎn)品設計、優化檢測流程等。對于此類變更注冊的申請，需要綜合考慮産(chǎn)品發生的具(jù)體(tǐ)變化及其對産(chǎn)品性能(néng)的影響，通過充分(fēn)的性能(néng)驗證保證變更後産(chǎn)品的安(ān)全有(yǒu)效。
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審評六部 王佩榮 供稿
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